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盘点:固相筛选相关问题

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发表于 2024-12-16 22:17:17 | 显示全部楼层 |阅读模式
固相筛选法就是将纯化或充足的抗原包被在固相介质上(如酶标板、亲和层析柱和免疫试管),然后再加入带筛选的噬菌体抗体库孵育,经过多次“吸附-洗涤-解离-扩增”的过程,洗去非特异性结合或结合力弱的噬菌体抗体,回收结合上的噬菌体抗体。下面是一些固相筛选验过程:

一.抗原、抗体结合时间的选择

在包被抗原的ELISA板孔中,分别加入抗原噬菌体抗体以及非特异性的噬菌体抗体,结合时间可以设置1、10、20、30、45min及1、15、2h。用PBST洗涤5次后,加入1:5000HRP-羊抗M13抗体,再加入PBST洗涤5次,加HRP底物显色液并终止后,测定A值。

二.洗涤条件的选择

在包被抗原的ELISA孔板中,分别加入上述类型的噬菌体抗体,反应2h后,采用不同的洗涤条件进行洗涤,以PBST洗5次,以PBS和PBST各洗5次,以PBS洗5次后再以PBST洗10次,以PBS和PBST各洗10次,之后同上进行噬菌体的ELISA检测。

.缓冲液pH的选择

在包被抗原的ELISA板孔中,分别加入上述类型的噬菌体抗体,于37℃温育2h。分别采用pH3、4、5、6的醋酸醋酸钠缓冲液洗涤10min后,同上进行噬菌体抗体的ELISA检测。

四.抗原包被浓度对筛选结果的影响

用浓度分别为1、2、4、6及8mgL的抗原包板,加入100μL混合的噬菌体抗体,于37℃温育2h。然后以PBST和PBS各洗板20次,加入100μLEcoliTG1,于37℃温育1h。然后稀释105后涂板,置30℃培养过夜。从不同筛选条件所得的平板上各挑96个单菌落,进行噬菌体抗体的竞争ELISA检测。

五.噬菌体抗体的竞争ELISA法检测

噬菌体抗体上清与等体积MPBS(含40mLL牛奶的PBS)混合,室温静置30min。同样,将样品与等体积含抗原的MPBS混合,室温静置30min。各取100μL加入到包被抗原的板中反应1h,以PBST洗涤5次。加入1:5000HRP-羊抗M13抗体,于37℃孵育1h;同上洗涤后,加HRP底物显色液显色15min,以2molLH2SO4终止反应后,于波长450620nm测定A值。抗原竞争达到50%以上的克隆视为阳性,即有抗原竞争的A值为抗原竞争的A值50%以下的克隆即为阳性。

六.洗涤过程产生的影响

严谨度过高,可使一些表达较低的克隆被筛掉,而这些克隆中可能含有亲和性极高的目的噬菌体;严谨度过低,又可导致噬菌体的富集过程太慢,筛选轮数增加。考虑降低洗涤强度(PBS洗涤液中不加土温)以及减少洗涤次数。

七.抗原浓度的确定

现在普遍认为:低浓度的抗原应先用于筛选高亲和力的抗体,而高浓度的抗原则有利于低亲和力抗体的筛选。需要注意的是,筛选用的抗原存在一个有效的浓度,不是所有用于包被的抗原都能有效的用于筛选,抗原的有效浓度必须要达到一定的值。但有效抗原浓度又不能高于10-6molL,此时反而会使特异性抗体的富集效果下降。

泰克生物建立了一个完善的、成熟的噬菌体抗体展示技术平台。基于噬菌体展示技术平台,泰克生物可以提供包括抗原、羊驼免疫、文库构建与筛选(固液筛选)、活性功能验证等主要验环节,并为全球的科学家筛选高特异性和高亲和力的驼科动物VHH抗体。



在过去的十年间,噬菌体展示战胜了很多的竞争对手,在摸爬滚打中奋勇前行,为客户打磨出很多的好产品。泰克生物为客户提供基于M13噬菌体抗体展示系统的高亲和力、高特异性的抗体药物前期发现技术服务,为客户后续的CAR-T/CAR-NK先导序列设计、抗体人源化、药物靶点抗体开发、双特异性抗体开发以及高效阻断型中和抗体开发等下游研发工作提供有力支持。https://www.tekbiotech.com/

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