聊聊PBMC分离

心灵美好

从外周血、骨髓、外周淋巴器官或各种组织分离出来的细胞是多种细胞的混合物。如要研究某种特定细胞的结构、功能或表面标志等特征，首先要分离纯化细胞。细胞分离可根据其大小、密度、表面电荷、吸附能力或表面抗原的差异而采用密度梯度沉降法、贴附、亲和层析、化环形成、补体介导杀伤溶解、免疫磁珠以及流式细胞仪（FCM）等方法来进行纯化。

一．Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMC原理

常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是1077±0001kgL的聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografn）（FH）分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分子量为400000。当密度为12gml仍未超出止常生理性渗透压，也不透过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

图1PBMC分离示意图

二．PBMC分离的验步骤

1在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2取肝素抗凝静脉血与等量Hanks液或RPMI1640液充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm，20min。
3离心后管内分为层，上层为血浆和Hank's液、下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一处以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4用弯头滴管插到云雾层，仔细吸取单个核细胞；也可采用先吸弃上层RPMI1640和血浆，然后收集富含PBMC的云雾层。将云雾层细胞置人另一短中管中，加人5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm离心10min，洗涤细胞两次。
5末次离心后，弃上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴02%台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。单个核细胞浓度（细胞数1ml细胞悬液）=4个大方格内细胞总数4×104×2（稀释倍数）。
6细胞活力检测：死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。活细胞百分率（%）=活细胞数总细胞数×100%。
7细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105ml培养基，加于六孔板或24孔板中进行培养。
8细胞收集：将六孔板或二十四孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200μLTrizol，用移液将孔壁吹打数次后，将Trizol转入EP管中。
9细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。

．验过程中的注意事项

1Ficoll应适量，外周血应充分稀释。
2温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果。
3在Ficoll上加入稀释后的外周血时，应缓慢加，以免冲散界面。
4吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染。

四．泰克生物羊驼PBMC产品势

1细胞活率高：验中使用的分离试剂菌、低内素，对细胞伤害刺激，操作人员具备多年PBMC细胞分离经验，比较大程度保证细胞的原始状态，分离后的新鲜细胞或冻存复苏后的活率可达90%以上。
2产品安全性高、传染源：严格把控羊驼骆驼全血来源，保证验骆驼均经过相关传染源检测，为客户提供更安全、更放心的验材料。
3细胞来源清晰、可溯源：分离羊驼骆驼使用的全血均由正规动物中心提供采集，具备完全合规的采购流程以及全血生物安全证书，免除客户使用的后顾之忧。

泰克生物具有成熟的动物免疫技术和PBMC分离技术，保证细胞分离过程中不受损害、不被刺激，后期的纯化技术保证骆驼单个核细胞的纯度以及活率等技术指标，适用于后期的细胞培养、抗体制备等其他研究。



正是因为噬菌体展示的迅猛发展，所以给行业也带来了新的契机。泰克生物为客户提供基于M13噬菌体抗体展示系统的高亲和力、高特异性的抗体药物前期发现技术服务，为客户后续的CAR-T/CAR-NK先导序列设计、抗体人源化、药物靶点抗体开发、双特异性抗体开发以及高效阻断型中和抗体开发等下游研发工作提供有力支持。https://www.tekbiotech.com/